ELISA原理、操作流程及常見問題解決方案
ELISA技術(shù)原理與核心機制
ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，通過酶標記放大信號實現(xiàn)目標物質(zhì)的定性與定量分析。其核心步驟包括：
固相包被：抗原或抗體通過疏水作用吸附于聚苯乙烯微孔板表面。
免疫反應(yīng)：樣本中的目標物與包被物結(jié)合，形成固相-抗原-抗體復(fù)合物。
信號放大：酶標記的二抗或抗原催化底物(如TMB)顯色，顯色強度與目標物濃度正相關(guān)。
主要ELISA類型及操作流程
1. 雙抗體夾心法(檢測大分子抗原)
步驟：
包被捕獲抗體 → 封閉 → 加樣本 → 加酶標檢測抗體 → 顯色。
需兩種抗體(捕獲+檢測)，避免交叉反應(yīng)。
適用場景：細胞因子(如IL-6)、病毒抗原(如HBsAg)檢測。
2. 競爭法(檢測小分子抗原/抗體)
原理：樣本目標物與酶標物競爭結(jié)合固相抗體，顯色信號與目標物濃度負相關(guān)。
關(guān)鍵點：適用于激素、藥物殘留等小分子檢測。
3. 間接法(檢測抗體)
優(yōu)勢：通過酶標二抗放大信號，靈敏度高于直接法。
注意：需驗證抗原純度，避免假陽性。
常見問題與解決方案
高背景值
原因：封閉不充分或洗滌。
解決：優(yōu)化封閉液(5%脫脂牛奶+0.05% Tween-20)，增加洗滌次數(shù)。
標準曲線不佳
排查：標準品溶解不充分或梯度稀釋誤差。
建議：使用“八槍頭法”減少加樣誤差，37℃水浴助溶。
假陽性/假陰性
樣本處理：避免溶血(血紅蛋白>0.2mg/ml抑制HRP活性)。
抗體驗證：通過Western Blot確認抗體特異性。
關(guān)鍵操作技巧
包被條件：4℃過夜包被優(yōu)于37℃短時孵育，減少蛋白變性。
加樣規(guī)范：槍頭垂直懸空加液，距孔底2-3mm。
顯色控制：TMB顯色時間通常為10-30分鐘，避免過度反應(yīng)。
注：ELISA試劑盒需2-8℃保存，避免反復(fù)凍融;不同批次試劑禁止混用。
注意：以上僅供參考，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。 Elisa試劑盒
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