競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)抗體親和力實(shí)驗(yàn)流程

　　競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)抗體親和力實(shí)驗(yàn)流程

　　一、實(shí)驗(yàn)原理

　　競(jìng)爭(zhēng)ELISA通過(guò)待測(cè)抗體與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原，顯色信號(hào)強(qiáng)度與抗體濃度成反比，適用于小分子抗原或半抗原的檢測(cè)?。

　　二、實(shí)驗(yàn)步驟

　　試劑與樣本準(zhǔn)備?

　　標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋(如S1-S7)，待測(cè)樣本平衡至室溫?。

　　特異性抗體稀釋為工作液(如1:100)，確保僅識(shí)別目標(biāo)抗原?。

　　競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)?

　　將樣本與抗體工作液加入包被抗原的酶標(biāo)板，37℃孵育1小時(shí)?。

　　洗滌3次去除未結(jié)合物質(zhì)(PBS+0.05% Tween-20)?。

　　酶標(biāo)二抗孵育?

　　加入酶標(biāo)二抗(如HRP標(biāo)記)，37℃孵育50分鐘，洗滌5次?。

　　顯色與終止?

　　加入TMB底物避光反應(yīng)20分鐘，終止液終止后5分鐘內(nèi)讀數(shù)(450nm)?。

　　數(shù)據(jù)分析?

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(抗體濃度 vs. OD值)，計(jì)算待測(cè)樣本的抗體親和力(IC50)?。

　　三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

　　洗滌

　　洗滌不充分會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)，建議洗板5次以上?。

　　孵育條件控制?

　　溫度波動(dòng)(如±1℃)或時(shí)間偏差(如±5分鐘)均影響結(jié)果穩(wěn)定性?。

　　試劑時(shí)效性?

　　酶標(biāo)抗體工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用(15分鐘內(nèi)使用)，避免活性下降?。

　　樣本預(yù)處理?

　　高濃度樣本需預(yù)稀釋，避免“鉤狀效應(yīng)"導(dǎo)致假陰性?。

　　四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決

　　信號(hào)弱?：檢查抗體效價(jià)、底物活性及孵育時(shí)間?。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線異常?：驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品濃度準(zhǔn)確性及稀釋操作規(guī)范性?。

　　注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。

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